一文教会你单细胞常规分析-cellranger使用
cellranger count流程：将FASTQ文件中的测序数据与参考转录组进行比对，并生成.cloupe文件用于在Loupe Browser中进行可视化和分析，同时生成与其他公开可用工具兼容的输出。从10x Genomics支持网站下载FASTQ文件，本示例使用人类外周血单个核细胞数据集。
cellranger multi：用于处理Cell Multiplexing数据集。细胞定量使用cellranger count，为Seurat分析准备数据。通过编写脚本，使用cellranger count命令执行分析，输出结果文件包括barcodes.tsv.gz、features.tsv.gz和matrix.mtx.gz。Seurat分析流程如下：过滤数据，生成小提琴图，有助于确定后续分析的阈值。
首先，创建文件夹用于存放软件和数据。然后，下载并解压cellranger软件。设置PATH环境变量，方便软件调用。准备fastq文件和参考基因组。对于原始测序数据，需使用cellranger mkfastq将其转换为fastq格式文件。已有fastq文件可以直接使用cellranger count进行定量分析，得到表达矩阵。
安装过程很简单，只需解压文件，生成的文件夹 cellranger-0 中包含可执行程序，最关键的是 cellranger 调用程序。安装完成后，你可以通过运行“cellranger-0/bin/cellranger -h”来检查是否成功安装。在开始单细胞测试前，准备测试数据。下载测试数据包括 Bcl 数据、样本信息表和参考数据库。
为了进行单细胞转录组的定量分析，我们首先需要安装CellRanger工具。10X Genomics提供了人和鼠的基因组参考index，对于其他物种，用户可以自行构建。接着，我们需要从EBI的ENA浏览器下载原始数据。
为了处理fastq文件，我们首先需要下载CellRanger。访问官网并填写所需信息后，从下载页面获取最新版本的软件。下载完成后，进行解压操作。接着，我们需要在环境变量中配置CellRanger，这可以通过在前面使用的sratoolkit环境中进行。下载参考基因组至关重要，通过官网获取并解压，准备好用于后续的分析。
单细胞分析方法
1、单细胞分析的方法包括显微镜观察、流式细胞术、单细胞测序等。其中，单细胞测序技术是最常用的方法之一，通过对单个细胞的基因表达和变异情况进行检测和分析，可以获得细胞的基因组学和转录组学信息。单细胞分析在医学领域具有广泛的应用价值。
2、在单细胞制备过程中使用商用细胞碎片清除解决方案有助于提高样品清洁度和目标细胞计数的准确性，特别是对于存活率低于70%的细胞制剂[4]。 基于液滴（droplet）的方法： 基于液滴的方法使用了DNA条形码技术对包裹在油滴中的单个细胞进行分析，大大减少了每次分析所需的时间和成本。
3、拟时序分化分析。分析亚群分化关系及分化过程中的功能变化，揭示亚群演变和功能诠释。第四步：TCR/BCR分析。若同时进行TCR或BCR实验，结合mRNA测序分析克隆扩增情况。单细胞数据分析步骤至此结束，优化分析内容和项目合作，积累了丰富的单细胞项目经验，提供完全定制化服务。
4、单细胞CNV分析方法 inferCNV inferCNV[1]是由Broad机构开发的比较权威的单细胞CNV分析工具，其分析思路为：在整个基因组范围内，将每个肿瘤细胞基因表达与平均表达或“正常”参考细胞基因表达对比，通过热图的形式展示每条染色体上的基因相对表达量。
单细胞数据处理小细节汇总
1、关于有些细胞属于同一个cluster但是在umap或者tsne图上相聚较远的问题：UMAP和TSNE是各自的算法在PCA降维的基础上再进行非线形降维，在二维图上把其各自算法认为相近的细胞聚在一起。
2、进阶使用for循环，如处理两个患者的鼻腔样本，使用cellranger后生成三个文件：barcodes、features和matrix。可以使用for循环读取数据、提取线粒体基因比例、QC筛选、在metadata中添加新的一列、进行归一化并计算高变基因，最后将P2和P3合并在一个list中。
3、单细胞数据需要进行标准化处理，以适应不同类型和级别的数据变化。归一化是关键，通常包括调整总测序读取计数，按比例缩放到总体计数深度。Scran利用基于池的大小因子估计与线性回归进行数据归一化，这是除seurat使用的简单对数归一化外，最流行的方法之一。
4、主要步骤包括质量检查、修剪、demultiplexing、对齐和量化。这与bulk RNA-seq类似，主要差异在demultiplexing和量化上，不同协议下操作可能有所不同。例如，ZUMIs适用于大多数基于UMI的协议，对于Smartseq2等配对端全转录本协议，数据可能已完成这些步骤，无需手动处理。
基因一级结构解析技术有哪些类型
基因的一级结构指的是DNA序列，而对DNA序列进行解析的技术有很多种。以下是常见的一些类型： Sanger测序法：利用化学方法逐个分离、检测DNA序列中每个核苷酸，得到目标基因的完整序列。
蛋白质的一级结构可以通过基因组编码分析和氨基酸序列分析进行确定。在生物化学中，一级结构分析是蛋白质组学研究的重要内容之一，有助于研究蛋白质分子的结构、功能和进化关系。蛋白质的二级结构是指蛋白质分子中局部主链的空间结构，主要包括α-螺旋、β-折叠、β-转角和无规卷曲等结构形式。
其次，一级结构对蛋白质的结构与功能具有决定性影响。氨基酸序列的不同导致蛋白质折叠成特定的二级（如α-螺旋和β-折叠）和更高层次的结构，进而影响其催化、信号传递和结构支撑等功能。解析一级结构有助于理解这些关系，为后续研究和应用提供线索。
分子生物技术主要包括：PCR技术、基因克隆技术、基因测序技术、基因编辑技术等。PCR技术是分子生物学中最核心的技术之一。它通过一系列反应步骤，对特定的DNA片段进行扩增，类似于工厂的复制过程。这一技术广泛应用于基因诊断、疾病检测以及生物学研究等领域。
生物信息学是一门交叉学科，它结合了生物学、计算机科学和数学等多个学科的知识，对生物数据进行分析和解释。生物信息学的研究内容包括基因序列分析、蛋白质结构预测、基因表达调控等。生物芯片技术是另一种重要的生物信息技术，它是一种将生物分子固定在芯片上进行分析的技术。
该物种的三维基因结构、染色体互作及动态变化可以解析啦~（从基因到表观！全方位解析） 周期短。