本文目录：
- 1、限制性核酸内切酶切割的原理和方法
- 2、酶切法原理
- 3、简述cdna文库构建步骤
- 4、甲基化酶的种类
- 5、DNA酶切及凝胶电泳基本描述
限制性核酸内切酶切割的原理和方法
1、限制性核酸内切酶切割的原理：限制性核酸内切酶作用于双链DNA的磷酸二酯键，这种酶能识别特定的碱基序列，并且有特定的切割位点。不同的限制性内切酶作用方式都不一样。不过大体来说，限制性内切酶都能够特异性识别并结合核酸的特殊反向回文序列（Inverted repeat palindromes ），然后催化断裂核苷酸链。
2、生物体内能识别并切割特异的双链DNA序列的一种内切核酸酶。它是可以将外来的DNA切断的酶，即能够限制异源DNA的侵入并使之失去活力，但对自己的DNA却无损害作用，这样可以保护细胞原有的遗传信息。由于这种切割作用是在DNA分子内部进行的，故名限制性内切酶（简称限制酶）。
3、限制性核酸内切酶是可以识别特定的脱氧核苷酸序列，并在每条链中特定部位的两个核苷酸之间的磷酸二酯键进行切割的一类酶，简称限制酶。DNA连接酶利用NAD或ATP中的能量催化两个核酸链之间形成磷酸二酯键。
4、酶切法原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。
5、I酶切点，切割后由环状DNA变为线形DNA。【材料】λDNA（0.1ug/ul），pBR322 DNA（0.25 ug/ul）限制性内切酶EcoRI EcoRI 酶切缓冲液（Buffer solution 10×）去离子水 电泳及染色用材料 【方法】取洁净EP管2只，按表10-1加入各成分。混匀，放370C水浴1-2h。
酶切法原理
酶切法原理：限制性内切酶能特异地结合于一段被称为限制性酶识别序列的DNA序列之内或其附近的特异位点上，并切割双链DNA。可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。
单酶切法：这是用一种限制性内切核酸酶酶切DNA样品。若DNA样品是环状DNA分子，完全酶切后，产生与识别序列数（n）相同的DNA片段数，并且DNA片段的两末端相同。若DNA样品本来就是线形DNA片段，完全酶切的结果，产生n+1个DNA片段数，其中有两个片段的一端仍保留原来的末端。
手机版 我的知道 请总结出dna单酶切分析的一般实验方法 我来答 分享 微信扫一扫 网络繁忙请稍后重试 新浪微博 QQ空间 举报 浏览1 次 可选中1个或多个下面的关键词，搜索相关资料。也可直接点“搜索资料”搜索整个问题。
其基本原理是：基因组DNA经两种限制性内切酶酶切，形成分子量大小不等的限制性酶切片段，然后把酶切片段与有共同粘性末端的人工接头连接，连接后的粘性末端序列和接头序列作为PCR反应引物的结合位点，通过PCR 反应对酶切片段进行预扩增和选择性扩增。选择性扩增产物在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶上电泳，寻找多态性扩增片段。
简述cdna文库构建步骤
【答案】：cDNA文库的构建一般分为以下四步：（1）细胞总RNA的提取和mRNA的分离；（2）cDNA第一条链的合成；（3）cDNA第二条链的合成；（4）双链DNA克隆进质粒或噬菌体载体，并导入宿主中繁殖。
用等量酚：氯仿对含有磷酸化cDNA（来自步骤6）的反应物进行抽提。 Sephadex G-50用含有10 mmol/L NaCl的TE（pH6）溶液进行平衡，然后通过离子柱层析将未掺入的dNTP和cDNA分开。
制备mRNA：通常mRNA约占总RNA的1%5%，所以应选用目的基因mRNA表达最丰富的组织细胞为材料来源，如获取胰岛素基因，应以胰岛β细胞为原始生物材料，细胞因子基因应选用经抗原或丝裂原刺激培养的淋巴细胞为材料。将提取的总RNA在寡聚脱氧核苷酸[oligo（dT）]纤维素中进行亲和层析，分离获得mRNA。
第一步：mRNA提纯确保获取到高质量的mRNA对于构建优质cDNA文库至关重要。这是整个过程中的基础步骤。第二步：cDNA第一条链合成使用Oligo（dT）作为逆转录引物，或者随机引物，引导cDNA的合成。第三步：cDNA第二条链合成完成第一条链后，通过逆转录酶作用，形成互补的第二条链，形成完整的cDNA分子。
甲基化酶的种类
Dam 甲基化酶可在 GATC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。
蛋白质精氨酸甲基化酶（PRMT）、蛋白质赖氨酸甲基化酶。
酶分类：DNA甲基化酶分为2类：即维持DNA甲基化转移酶（Dnmtl或维持甲基化酶）和从头甲基化酶。根据序列的同源性和功能，真核生物DNA甲基化转移酶又分为4类：Dnmtl/METl、DnmtCMTs和Dnmt3。DnmtliiMETl类酶参与CG序列甲基化的维持。
在哺乳动物中，目前已发现4种DNA甲基转移酶（Dnmts），根据结构和功能的差异分为两大类：分别以Dnmt1和Dnmt3为代表。
DNA甲基化作用主要是DNA甲基转移酶以S-腺苷甲硫氨酸（SAM）为甲基供体，将甲基转移至碱基特定结构上的过程。哺乳动物中90%的DNA甲基化修饰是由DNA甲基转移酶识别DNA的5CG-3序列（CpG），并将SAM的甲基转移至胞嘧啶C-5位上。
DNA酶切及凝胶电泳基本描述
它可分为三类：Ⅰ类和Ⅲ类酶在同一蛋白质分子中兼有切割和修饰（甲基化）作用且依赖于ATP的存在。Ⅰ类酶结合于识别位点并随机的切割识别位点不远处的DNA，而Ⅲ类酶在识别位点上切割DNA分子，然后从底物上解离。
在制作酶切图谱时，使用0.5-1μg DNA，酶的反应条件需根据酶特性调整。琼脂糖凝胶电泳是DNA片段分离的标准技术，通过电泳分离不同大小的DNA片段，琼脂糖浓度和电场强度对结果有重要影响。此外，荧光染料可帮助检测和定位DNA片段，而离子强度和缓冲液的选择也会影响电泳效果。
实验二质粒DNA的酶切鉴定及琼脂糖凝胶电泳实验目的和要求学习和掌握限制性内切酶的特性、酶解和琼脂糖凝胶电泳的操作方法，并理解限制性内切酶是DNA重组技术的关键工具，琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定DNA片段的有效方法。相关基础知识限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶。
电泳：接通电源，保持60-80V电压和40mA以上电流。观察溴酚蓝条带，当到达凝胶前沿2cm时停止电泳。 染色与观察：EB染色后在紫外灯下观察，记录DNA片段的荧光条带。制作DNA分子量标准曲线，用于测定片段大小。 结果分析：根据电泳照片测量DNA片段的迁移距离，通过标准曲线计算分子量。
12000 rpm离心5 sec，将管盖及管壁上的水离下。 取10 μl消化产物，与2 μl 6×上样缓冲液混匀，琼脂糖凝胶电泳检测消化效果，电泳条件：约100 V 30～60 min。6 结果观察。
将清洁干燥并经灭菌的eppendorf管（最好0.5ml）编号，用微量移液枪分别加入DNA 1μg和相应的限制性内切酶反应10×缓冲液2μl，再加入重蒸水使总体积为19μl，将管内溶液混匀后加入1μl酶液，用手指轻弹管壁使溶液混匀，也可用微量离心机甩一下，使溶液集中在管底。