实验干货|如何用线粒体膜电位(JC-1)法做好细胞凋亡检测
1、实验步骤如下：配制1ml JC-1染色工作液，用于每孔或每50-100万细胞。设置阳性对照，使用CCCP处理细胞后观察荧光变化。对悬浮细胞，先重悬、混匀，37℃孵育后离心洗涤，再用荧光显微镜或分析仪器检测。对贴壁细胞，建议先消化再孵育JC-1，以保证染料均匀进入。
2、掌握JC-1实验的每一步至关重要。首先，我们需要配制精确的JC-1染色工作液，为细胞提供所需的荧光环境。在阳性对照中，通过加入CCCP观察线粒体膜电位的丧失，为实验提供标准。悬浮细胞的操作流程包括细胞悬液的制备、染色、离心洗涤以及荧光观察，每一个环节都需要细心处理，以确保结果的准确性。
3、进行JC-1线粒体膜电位荧光探针染色步骤（流式细胞仪法）：首先，选择合适的化合物进行凋亡诱导，细胞密度不超过1×106cells/mL。其次，取细胞悬液至无菌离心管，室温400 x g离心5 min，吸去上清，用JC-1工作液重悬细胞，于37℃，5%CO2培养箱孵育15-30 min。
4、JC-1是一种荧光亲脂性羰花青染料，用于测量线粒体膜电位。在体外研究中，当暴露于鼠L1210淋巴母细胞时，JC-1（5μM）能够检测到细胞质JC-1单体和线粒体JC-聚集体的存在。通常，JC-1荧光由流式细胞仪中的488 nm激光波长激发。
5、JC-1在水相容易形成聚集体，所以需要边振荡边加。未用完的JC-1不要再保存至－20℃。 37℃避光保存10分钟。 加入2ml PBS至细胞悬液中，500g室温离心5分钟，去上清。 以0.3ml PBS重悬细胞。上机取样，注意获取细胞的速度不要250至300细胞/秒。
6、通过JC-1从红色荧光转变为绿色荧光，可以评估线粒体去极化的程度。在使用Elabscience线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1）进行检测时，结果显示正常细胞中有少量凋亡现象，表现为线粒体膜电位部分崩塌的细胞。相比之下，CCCP阳性对照组的几乎所有细胞都显示出线粒体膜电位的完全崩塌。
国自然热点!线粒体自噬机制和检测方法
1、检测线粒体自噬相关蛋白的方法通常需要通过化学诱导促进自噬发生，然后利用免疫印迹、免疫荧光或流式细胞术等技术手段对相关蛋白进行定量分析。以BNIP3为例，BNIP3L/NIX与BNIP3在低氧条件下被激活，形成同源二聚体锚定在线粒体外膜上，促进线粒体自噬。
2、线粒体自噬功能的失常与这些疾病之间存在着紧密的关联，研究者们通过多种方法来揭示其功能，包括利用荧光标记的JC-1来检测线粒体的活力、测定ATP含量以及使用抑制剂如环孢素A来观察其影响（张迎梅，2013）。
3、目前，研究线粒体自噬的方法多样，但无法独立反映线粒体自噬的活性。主要方法包括线粒体功能检测、形态观察、自噬标志物检测以及抑制线粒体自噬的手段。线粒体自噬的研究对理解多种疾病机制至关重要。进一步剖析线粒体自噬的分子机制，开发靶向线粒体自噬的小分子药物，是当前亟待解决的问题。
4、细胞自噬有三种类型：巨自噬通过膜包裹物质；微自噬是溶酶体直接吞噬；分子伴侣介导自噬则先恢复蛋白质折叠再送入溶酶体。检测自噬的方法包括透射电镜观察、Western Blot（WB）检测LC3等标志物，以及荧光显微镜观察GFP-LC3或mCherry-GFP-LC3来追踪自噬进程。
线粒体膜电位检测
1、JC-1是一种荧光亲脂性羰花青染料，用于测量线粒体膜电位。在体外研究中，当暴露于鼠L1210淋巴母细胞时，JC-1（5μM）能够检测到细胞质JC-1单体和线粒体JC-聚集体的存在。通常，JC-1荧光由流式细胞仪中的488 nm激光波长激发。
2、染色步骤如下：首先收集细胞悬液，并调整至1ml。然后制备阳性对照，以去极化药物处理过的细胞作为参照。接下来，融化1管JC-1储存液，每1ml细胞悬液中加入5L（终浓度：5ug/ml），并振荡直至标本形成均一的红紫色。JC-1在水相中容易形成聚集体，因此需要边振荡边加染料。
3、线粒体膜电位（MMP）作为细胞能量转换的关键指标，其检测具有重要意义。线粒体通过膜电位的形成与维持，调控细胞的生化过程。当MMP异常时，可能预示着细胞健康状况的恶化，与多种疾病的发生紧密相关，如阿尔茨海默病、糖尿病和癌症等。
4、进行线粒体膜电位检测实验时，需要准备线粒体膜电位检测试剂盒（JC-1法）、倒置荧光显微镜和细胞培养箱等仪器。实验步骤包括： 配制JC-1染色工作液，先稀释JC-1，再加入染色缓冲液，充分混匀。 设置阳性对照，使用CCCP处理细胞，观察线粒体膜电位变化。