细胞增殖检测——MTT法
MTT法，又称MTT比色法，是一种广泛应用于检测细胞存活和生长的常用方法。检测原理是，活细胞中的线粒体琥珀酸脱氢酶能够将外源性MTT还原成不溶于水的蓝紫色结晶甲臜，并沉积在细胞中。而死细胞则不具备这一功能。
综上所述，MTT法是细胞增殖检测中的一种有效方法，通过精确控制实验条件和参数，可以获得准确的细胞活力和增殖情况数据。在实验过程中，需注意细胞培养、MTT添加、反应时间、检测波长等关键步骤，以确保实验结果的可靠性。如果遇到问题，可以考虑替换为CCK-8实验，尽管其费用稍高，但操作更为简便。
细胞增殖检测方法：MTT法 MTT法主要以3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝作为基础，该物质在活细胞线粒体中的呼吸链作用下，tetrazolium环开裂生成蓝色的formazan结晶，其生成量与活细胞数目成正比。
在选择细胞增殖检测方法时，MTT法（3-（4，5-二甲基噻唑-2-基）-2，5-二苯基四唑溴化物）和CCK8（细胞计数检测试剂盒）都有其特点。MTT法通过活细胞的线粒体还原外源MTT形成结晶，然后测定其溶解后吸收值，反映细胞存活。但其操作复杂，可能影响实验结果准确性，并且存在致癌风险。
6cm培养皿铺板密度
1、个细胞。6cm培养皿铺板密度是很高的，为105个细胞。培养皿是一种用于微生物或细胞培养的实验室器皿，由一个平面圆盘状的底和一个盖组成，一般用玻璃或塑料制成。
2、cm皿：55cm，能容纳大约1×10^7个细胞（L929），铺板密度在300-500万，相当于1：4或1：5的传代效果。15cm皿：148cm，可加30ml培养液，收取上清液一般加20ml。
3、在开始之前，确保你的293T细胞状态良好，建议前一天晚上铺板，第二天生长到对数期进行转染，避免细胞老化影响效果。转染前，将细胞传至100mm培养皿，细胞密度达到80%-90%。
293T细胞转染
如果293T细胞转染时的细胞密度过低，可以采取以下措施：增加细胞接种密度：由于293T细胞生长迅速，可以在转染前适当增加细胞的接种密度，确保在转染时细胞密度达到推荐的30%50%范围。这可以通过调整细胞传代的比例或时间来实现。
HEK 293T细胞的人胚肾细胞特性使其成为实验中不可或缺的工具。我通常使用DMEM高糖培养基配合10%的胎牛血清以及1%的抗生素-抗生素混合液进行培养，培养箱设置为5%二氧化碳和37℃的条件。转染是将特定基因或质粒转入细胞内，以达到短暂表达目的，适用于短期实验。
遵循以上步骤进行PEI转染293T细胞操作，可提高转染效率，稳定实验结果。正确配制溶液、无菌操作以及恰当的储存条件对于解决转染效率不稳定与低效问题至关重要。通过精细操作与遵循最佳实践指南，实验者能够有效提高转染293T细胞的成功率，为后续研究奠定坚实基础。
慢病毒载体整合入293T细胞的详细过程如下：首先，准备293T细胞培养环境。使用无抗生素的DMEM培养基加上10%的胎牛血清（FBS）铺板，每孔2毫升，确保细胞在第二天达到80%到90%的融合度。接下来，进行转染步骤。稀释目的基因质粒（例如pWPXLd-目的基因）和辅助质粒（psPAX2和pMDG）到适当浓度。
细胞是人肾上皮细胞系，有多种衍生株，比如HEK293，293T/17等，来源都是人胚胎肾细胞，其极少表达细胞外配体所需的内生受体，且比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
一般认为，在转染后的第24~48 h之间，是慢病毒的生产高峰，这时病毒产生速率高于降解速率。可以在这个时间收获第一批慢病毒，此时也是滴度最高的时候。在随后的 48~72 h中，包装依然持续进行，但滴度下降（生产能力下降，但降解速率不变）。
有谁知道MTT详细的流程和注意事项啊?谢谢了!!!
1、在进行贴壁细胞MTT实验时，需注意以下步骤：首先，收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度至每孔100ul，铺板密度为1000-10000孔/板（边缘孔用无菌PBS填充），然后在5%CO2，37℃条件下孵育至细胞单层铺满孔底。
2、操作步骤：将悬浮细胞培养至对数生长期，用PBS洗涤，离心300g，5分钟。去除上清液，调整细胞浓度至1×10^5，接种于96孔板，每孔1000-10000个细胞，200ul体积。37℃，5%CO2条件下培养16-48小时。
3、MTT的使用和注意事项包括：测定范围、新鲜配制、避光保存，以及使用时的安全措施。细胞接种步骤贴壁细胞：调整细胞密度，铺板后加入药物，孵育观察，加入MTT和二甲基亚砜进行测量。悬浮细胞：调整细胞悬液浓度，加入药物和MTT后直接测量，离心后溶解结晶物并测量吸光值。
4、在进行MTT实验时，了解加药间隔是非常重要的，建议查阅相关文献或进行多个梯度的实验。MTT实验中，MTT会形成结晶并容易分离，因此在使用96孔板时需轻柔操作，避免用力过猛。推荐使用枪头缓缓吸取，比如将96孔板倾斜30度，沿着孔壁缓缓清洗掉MTT，避免反复倾斜96孔板，以免吸掉结晶。
96孔板铺板密度过大会导致什么问题
会导致细胞分布不均匀。遇到这种情况可以手动解决。植板后，用手拿起96孔板，左右摇动，然后来回摇动几次，可以使细胞分布均匀。在96孔板的每个孔上，加入100微升的细胞悬浮液。把它从左边加到洞底。加入一半板材后，与未加入的细胞悬浮液混合，然后继续加入剩余的一半板材。
在进行96孔板铺板时，均匀性是一个关键因素，它分为两种：孔间的均匀和孔内的均匀。孔间的均匀性可以通过使用多通道移液器，即通常所说的排枪，配合相应的加样槽来实现。这种方式能够确保每个孔中添加的液体量一致，从而达到孔间均匀的效果。如果逐孔添加液体，很难保证每孔之间液体量的均匀分布。
在细胞生物学实验中，细胞铺板是常见的一个环节。许多实验者在操作时，可能会遇到细胞分布不均匀的问题，如中间密集周围稀疏或周围密集中间空洞。为了解决这一问题，我分享一些实用的技巧。首先，对于96孔板，我通常每孔加入100微升的细胞悬液，从孔的左下角开始加入。
孔板相比96孔板来说，更容易使细胞铺匀，如果操作不当，细胞可能会集中在边缘区域。因此，在添加2ml的细胞悬液时，应将其放置于孔板的中心位置，让其自然向四周扩散。然而，新购置的孔板有时会出现扩散不良的情况，这时可以轻轻摇晃孔板或轻触板底，促使细胞更好地分散。
细胞的生长速度以及你的铺板密度。MTT最好还是吸出来，因为倒的力度太小，溶液倒不干净；力度太大又可能把结晶也倒掉了。如果用枪头吸取，可以倾斜30度慢慢地吸，一定不要把结晶吸出来，也可以用注射器吸取。总的原则就是既要把MTT溶液吸干净，又不能让结晶有所损失，否则都将影响最后的OD值。
将细胞悬液在完全培养基中稀释后，在96孔板中铺板，使得最终体积为100微升，使细胞密度达到50%左右。合适的接种密度为6 /mL。