干货丨活/死细胞双染色试剂盒(绿/红)的工作原理
1、活/死细胞双染色试剂盒（绿/红）是一种便捷的评估细胞活力的方法。它采用两种探针同时检测活细胞和死细胞，依据细胞膜完整性和细胞内酯酶活性的差异。绿荧光染料LiveDye（Ex / Em = 488/530 nm）渗透活细胞并着色，而不可渗透死细胞的红荧光染料NucleiDye（Ex / Em = 535/617）则用于着色死细胞。
2、Calcein-AM是一种细胞染色试剂，用于标记活细胞，产生绿色荧光。其通过引入乙酰甲氧基甲酯（AM）基团，增强了疏水性，易于穿透活细胞膜。进入细胞后，Calcein-AM被酯酶剪切形成Calcein，产生强绿色荧光，用于活细胞染色。相比同类试剂，Calcein-AM的细胞毒性极低，不影响细胞功能，如增殖和淋巴球的趋化性。
3、将100 μl染色工作液与200 μl细胞悬液混合，于37℃条件下反应15分钟。使用490±10 nm激发波长观察活细胞的绿色荧光，以及545 nm激发波长单独观察死细胞的红色荧光。这套试剂盒由biofount范德生物提供，货号为HCQ000978，是细胞活力检测的重要工具。
4、℃。活死细胞染色试剂盒是一种疏水化合物，容易渗透完整的活细胞，进入细胞后被酯酶水解产生强烈荧光，用PBS洗涤细胞两次，4℃避光孵育15-30分钟即可染色。
【求助】流式细胞仪检测细胞凋亡结果该怎样分析
1、在进行流式细胞仪检测细胞凋亡时，我遇到了一些困惑。我使用的是AnnexinV-FITC凋亡试剂盒，采用AnnexinV/PI双染方法检测细胞凋亡。然而，当我得到凋亡散点图后，发现关于1，2，4象限代表的细胞类型说法不一。
2、手里的资料说法都不相同。试剂盒说明书：1代表细胞收集过程中机械性损伤的细胞，2 代表继发性坏死细胞，4代表凋亡细胞。有资料说：1代表坏死细胞，2代表晚期凋亡细胞，4代表早期凋亡细胞。我就不明白了，既然是凋亡，就算是晚期，细胞膜也会破坏？还有的认为，2象限代表晚期凋亡和继发性坏死的细胞。
3、细胞碎片较多：碎片增多可能源于细胞固定或渗透性处理不当，影响实验准确性。调整固定时间与渗透条件，确保细胞结构完整。0正常组阳性率异常：正常组阳性率过高可能由背景荧光过高、染色剂浓度不适当或样本处理不当引起。调整染色剂浓度，控制样本处理过程，减少背景干扰。
4、一般都是计数一个固定值，比如10000，然后得到每个GATE里面的比率。对比比率。每组多做几个样本。组间比例对比可以用T test。
您关心的流式细胞术检测细胞凋亡(FITC-PI),来了!
为进行细胞凋亡的FITC-PI检测，首先收集要用于细胞凋亡检测的细胞，离心并去除培养基。然后，用PBS洗涤细胞一次，重悬于1×Binding Buffer中。对于对照组，使用400μL的1×Binding Buffer，其他处理组则使用100μL的1×Binding Buffer。
流式Annexin-FITC /PI双染法是一种常用的检测细胞凋亡的方法。在流式细胞术中，通过Annexin-FITC和PI对细胞进行染色，可以将细胞分为几个不同的象限，每个象限代表了细胞的不同状态。左下象限通常表示的是正常状态的细胞，这些细胞既不表达Annexin-FITC也不表达PI，表明它们没有经历凋亡过程。
流式检测细胞凋亡的原理 Annexin V和PI双染法是经典的细胞凋亡检测方法，基于凋亡早期细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）从内侧翻转到表面这一原理。Annexin V-FITC标记有助于识别早期凋亡细胞，而PI-DNA复合物可用于检测所有阶段的细胞死亡。
annexin FITC/PI 双染试剂盒在染色时确实需要使用专门的buffer来稀释染色试剂，而不是直接使用PBS。因此，在进行染色之前，应当先对PBS进行离心处理，去除其中的杂质，然后再加入用buffer稀释的染色试剂，随后进行上机检测。
再次离心，去除上清，加入PBS洗3次，加入PI染色液，37℃染色30min。最后，将细胞上流式细胞仪检测。细胞凋亡检测：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生，破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸（PS）可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在DNA片段化之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。
Q2：（AnnexinV+FITC）+/PI+，此区域的细胞为晚期凋亡细胞。Q3：（AnnexinV-FITC）+/PI-，此区域的细胞为早期凋亡细胞。Q4：（AnnexinV-FITC）-/PI-，此区域的细胞为活细胞。资料扩展：细胞（英文名：cell）并没有统一的定义，比较普遍的提法是：细胞是生物体基本的结构和功能单位。
【罗工流式秘籍19】流式凋亡双染实验的技巧小结
选择合适的凋亡双染试剂盒。在选购试剂盒时，要考虑到样本的荧光特性，如是否含有自发荧光。常见的组合有AnnexinV-FITC+PI或AnnexinV-PE+7-aad。根据样本的具体情况，选择最合适的试剂组合至关重要。样本制备的技巧。在准备样本时，需降低对细胞膜的损伤，避免假阳性的出现。
分析流程涉及关键步骤：选择通道、设定群数、生成图像。通过flowsom，自动识别细胞群，排除非目标群，筛选出值得分析的细胞亚群，如CD4T、CD8T、NK、NKT、B细胞、单核细胞等。分析后，借助其他插件如cluster可视化亚群抗原表达，明确细胞特性，为深入分析奠定基础。
细胞主动性死亡--凋亡的检测方法
1、形态学检测通过光学显微镜观察细胞形态，Hoechst染色是常用的方法。正常细胞核在Hoechst染色后呈现蓝色，而凋亡细胞的细胞核则会密集染色，近乎白色。具体步骤包括：细胞固定、染色、洗涤并使用荧光显微镜观察。以碧云天公司的Hoechst染色试剂盒为例，操作涉及贴壁细胞、悬浮细胞和组织切片的处理过程。
2、Annexin V和PI双染法是流式检测细胞凋亡的经典方法 ，它是基于凋亡的早期细胞膜上的磷脂酰丝氨酸（phosphotidylserine， PS）从细胞膜的内侧翻转到细胞膜的表面这一原理来实现的（如下图3）。
3、Annexin V和PI双染法是经典的细胞凋亡检测方法，基于凋亡早期细胞膜上磷脂酰丝氨酸（PS）从内侧翻转到表面这一原理。Annexin V-FITC标记有助于识别早期凋亡细胞，而PI-DNA复合物可用于检测所有阶段的细胞死亡。通过将这两种试剂结合使用，可以有效区分活细胞、早期凋亡细胞、晚期凋亡细胞和坏死细胞。
4、此外，线粒体膜电位检测、活化的caspase-3检测和DNA片段化的检测也是细胞凋亡的检测方法。线粒体膜电位的改变可通过JC-1染料检测，活化的caspase-3检测则需通过特异性抗体标记，DNA片段化检测则利用FITC标记的DUTP或BrdU掺入到DNA缺口，通过检测信号强度判断片段化程度。
细胞实验常用的实验耗材-实验室仪器-实验试剂大汇总
1、细胞爆碎器和提取液：用于裂解细胞并提取蛋白质或核酸。蛋白质测定试剂盒和光度计：用于测定细胞培养物中的蛋白含量。细胞增殖试剂：如MTT试剂、CCK-8试剂等，用于测定细胞增殖能力。细胞凋亡检测试剂盒：用于检测细胞凋亡程度。低温冰箱、-80冰箱和液氮罐：主要用于试剂、细胞的保存。
2、生物实验室常用的耗材种类繁多，主要包括常规耗材、细胞培养类耗材、分子生物学实验耗材、微生物学实验耗材、过滤/净化实验耗材、仪器设备专用耗材以及试剂类耗材。常规耗材是生物实验室中最广泛使用的，它们具有通用性，包括各种玻璃器皿如试管、烧杯、量筒等，以及塑料制品如吸头、吸管、离心管等。
3、微生物实验室常用仪器有：恒温培养箱、霉菌培养箱、生化培养箱、超净工作台、高压灭菌器、烘箱、加热板、电炉、电子分析天平、磁力搅拌器、水浴锅、摇床、离心机、低温保存箱、移液器、PH计、分光光度计、光学显微镜、扫描显微镜、均质器等。